Ligne de commande
Vaccination d'un l'animal hôte avec l'anticorps (s) de une espèce différente peut générer des anticorps secondaires. Par exemple, par injection souris anticorps dans un animal non une souris élever anti-souris anticorps secondaires. De chèvre, âne, et lapin sont le plus couramment utilisé hôte espèces pour produire des anticorps secondaires.
Les types les plus communs de anticorps secondaires sont ceux générés contre un mis en commun population d'immunoglobulines de une espèce cible.
Par exemple, vaccination d'un chèvre avec purifiée IgG de souris va générer de chèvre anti-souris IgG anticorps qui oblige à tous les classes, lourd et chaînes légères (H L) et fragments de souris IgG ainsi que tout autre molécules partageant la strictement domaines conservés (e.g., igM partager la même kappa chaînes légères comme IgG).
En contraste, vaccination d'un chèvre avec seulement souris IgG1 anticorps vont générer des anticorps spécifiques de souris IgG1 anticorps et molécules partageant la strictement domaines conservés.
En raison du degré élevé de conservation dans la structure de de nombreux immunoglobuline domaines, classe-spécifique anticorps secondaires doivent être purifiés par affinité et croix-adsorbé de parvenir à un minimum croix-réaction avec autres immunoglobulines.
Immobilisé souris IgG1 anticorps peut purifier tous de chèvre des anticorps qui se lient à souris IgG1 en utilisant l'exemple ci-dessus. Passage à travers une colonne de chromatographie (s) contenant souris IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, etc., contribuerait à affiner ces anti-souris IgG1 anticorps à supprimer toute croix-réagir anticorps avec non-IgG1 isotypes.
En outre, passage par colonnes contenant immobilisé protéines sériques de espèces autres que ceux utilisés à vacciner le hôte peut encore purifier anticorps secondaires. Cette méthode de croix-adsorption (souvent désigné comme "Très Croix-Adsorbé") est une purification supplémentaire étape recommandé pour applications lorsque vous utilisez primaire anticorps à partir de plusieurs espèces et quand immunoglobulines ou d'autres sérum protéines peut être présent dans les échantillons sondé.
Ligne de commande Produits
| Anticorps | Application |
| Lapin IgG | Pour immunodiagnostique: ELISA, LFA, CLIA |
| Souris IgG | |
| Souris IgM | |
| Poulet IgY | |
| De chèvre Anti IgG De Souris | |
| De chèvre Anti Lapin IgG | |
| De chèvre Anti Poulet IgY | |
| Souris Humain Anti IgG |
Isotype Contrôle
Le but principal de la isotype contrôle est à déterminer que la liaison de l'anticorps primaire est spécifique, plutôt que non-spécifique Fc récepteurs ou interactions avec d'autres protéines. Il peut également lier anticorps compétitifs et effectuer la même fonction comme fonction-blocage anticorps.
Le isotype contrôle devrait être tout à fait compatible avec la source de l'anticorps primaire, Ig taper, et l'étiquetage.
UN sérum normal peut être utilisé comme un témoin négatif en immunofluorescence l'étiquetage si l'anticorps primaire est polyclonaux. En raison des différentes sources de fluorescence étiquetés mAbs, sans étiquette mAbs de la même source devrait être utilisé comme isotype contrôles à ajuster coloration de fond. Par exemple: par exemple, si les anticorps primaire est souris anti-rat CD11b et clone OX-42 purifiée IgG, son isotype est souris IgG2a, ainsi purifié souris IgG2a peut être utilisé comme la isotype contrôle ou OX-42.
Isotype contrôle: se réfère à la même immunoglobuline sous-classe comme Moab dans non immunisés souris, facteurs tels que cellulaire l'autofluorescence, FC véhiculée par les récepteurs liaison de l'anticorps, et non-liaison de l'anticorps spécifique ont été principalement pris en considération. Si immunofluorescence directe coloration est utilisé, le contrôle isotype devrait également être étiquetés avec pigments fluorescents, comme IgG1 FITC, IgG2a, PE, etc. En outre, le contrôle isotype et Moab-étiquetés fluorochrome concentration et F:P ratio (le ratio de étiquetés fluorochrome à immunoglobuline molécules) devrait être le même que le meilleur, Qui est vital pour un réglage précis de négative et positive cellulaire monuments Sens. Ne pas utiliser un isotype contrôle qui ne correspond pas à MoAb, de préférence un produit préparé par le même laboratoire et en utilisant le même processus ou méthode (tels que le même marque).
Isotype Contrôle Cytométrie en flux
Le Fab fragment de l'anticorps peut se lier à la surface cellulaire avec faible affinité et non-spécificité, en particulier lorsque la cellule est mort ou la membrane cellulaire est endommagé; cette non-fixation spécifique sera plus évident. Donc, isotype contrôles sont souvent utilisés dans des expériences visant à déterminer fond fluorescence niveaux.
Le contrôle isotype utilisé pour être un classique de référence en cytométrie en flux. À atteindre la même croix-réactivité entre la isotype contrôle et l'anticorps, le isotype, espèces, fluorescéine, fluorescéine, une protéine rapport, concentration, et d'autres indicateurs doit être cohérente.
Précautions:
1. Si l'antigène expression est une distribution bimodale, et le négatif et positif crêtes sont séparées, les résultats expérimentaux peut comprendre à travers la distribution bimodale.
2. Si la culture les cellules ont besoin pour être détecté, ensuite la mise la isotype contrôle à ce temps ne peut obtenir des informations reflétant la cellule capacité d'adhérence, et il est difficile d'obtenir des informations reflétant sa non-fluorescence spécifique. Donc, la mise en place un isotype contrôle à détecter les cellules cultivées est pas idéal.
3. Si une variété de fluorescéine est utilisé dans l'expérience à la même temps, lors de l'analyse, il se trouve que la fluorescence fuite a un impact significatif sur les résultats, et la fluorescence de fond n'est pas apparente, il est pas adapté à ensemble la isotype contrôle à ce temps. Bon choix. (FMO contrôles sont des cellules de la même espèce, teinté avec tous les autres fluoresceins avec un fluorescéine enlevé de sorte que la fuite de la divers fluoresceins à la sans étiquette canal peut se manifester et la porte peut être placé en place, donc, est un contrôle nécessaire pour valider. Et la FMO contrôle est seulement important quand il est essentiel de distinguer entre positif et négatif avec précision. FMO contrôle est maintenant couramment utilisé dans multicolore expériences et est nécessaire pour multicolore expériences.)
4. Lorsque vous utilisez le contrôle isotype, il se trouve que la non-fixation spécifique niveau est très haute, qui peut être due à la liaison de la non-spécifique Fc fin à la cellule, résultant en un non-signal spécifique, donc attention à Fc blocage.
5. Il est nécessaire de comprendre que le contrôle isotype est seulement une référence pour nous aider à filtrer certains facteurs qui ont une incidence sur l'expérience, mais nous ne pouvons pas déterminer le positif et négatif coupure points ou ensemble un porte sur cette base. Nous devons savoir que le contrôle isotype ne peut que refléter la fluorescence de fond de non-fixation spécifique, et la fluorescence de fond est également causée par d'autres facteurs, tels que l'autofluorescence, compensation élevé, anticorps, les méthodes d'étiquetage, instruments, d'autres réactifs ou l'analyse des données, et d'autres facteurs auront une incidence sur la fluorescence de fond.
6. Il est nécessaire pour titrer la cible anticorps à réduire la fluorescence de fond de non-fixation spécifique, et il est pas adapté à ensemble un isotype contrôle. En raison de la quantité excessive de anticorps, négatif de glissement à l'extrême et base l'élargissement va se produire.
7. Si la signalisation cellulaire et cytokines sont détectés dans l'expérience, la FMO contrôle et le négatif lutte biologique devraient être ensemble, en accordant une attention particulière à non stimulées cellules ou les cellules traitées avec la phosphorylation inhibiteurs.
8. La viabilité cellulaire colorant est ajouté à la multicolore régime à éliminer les cellules mortes. Parce que la non-coloration spécifique de cellules tués est extrême, si pas enlevé, elle entraînera une augmentation non-fixation spécifique et affecter l'expérience.
9. Il est disponible à définir d'autres contrôles outre le contrôle isotype dans différentes situations. Par exemple, pour sans tache cellules, déterminer témoins négatifs pour le fond et l'autofluorescence, ensemble la PMT tension;
Pour entièrement teinté cellules, déterminer certains hors-axe événements, ensemble la PMT tension; pour unique-teinté cellules/microsphères, ajuster compensation; Non stimulées Ou échantillons d'eut non traités ont, expérimental témoin négatif; positive cellules (stimulée ou traités avec certains médicaments), positive de commande pratique.
